Máy điện di

Tác giả 17/06/2019 29 phút đọc

MÁY ĐIỆN DI

Mục lục

MÁY ĐIỆN DI

Máy điện đi dùng để phát hiện và xác đinh AND trong tế bào vi sinh vật, thực vật và động vật.

1.1. AXIT DEOXYRIBONUCLEIC (ADN) VÀ NGUYÊN TẮC XÁC ĐỊNH

Gen là đơn vị di truyền cơ bản. Nó là một đoạn AND (đôi khi ARN) mã hóa thông tin cho việc tổng hợp sản phẩm sinh học xác định (chủ yếu là protein). Những nghiên cứu hiện đại về cấu trúc và chức năng của nguyên sinh chất đã mở ra những hiểu biết mới về cấu tạo và chức năng của tế bào.

Cấu trúc AND cho phép giải thích tại sao lại có khả năng tang trữ và di truyền thông tin từ thế hệ này sang thế hệ khác một cách ổn định và bằng cách nào nó thông tin di truyền ở dạng thứ tự sắp xếp các gốc nucleotit lại chuyển hóa thành phân tử protein chức năng. Nội dung nêu trên liên quan đến giáo lý trung tâm của di truyền phân tử gồm 3 điểm chính: sao chép thông tin di truyền từ AND bố mẹ sang AND con cái, chuyển đổi mã di truyền từ AND sang ARN – quá trình phiên mã (transcription) và dịch mã di truyền (transcription) – thông tin di truyền từ mARN được chuyển sang trình tự sắp xếp đặc hiệu của axit amin trong phân tử protein.

Công nghệ AND tái tổ hợp – hiện là nền tảng cho sự phát triển như vũ bão của ngành công nghệ sinh học hiện đại.

Các phương pháp phân tích và tổng hợp hiện đại là tách DNA, xác định thứ tự, tổng hợp, gắn xen nó vào vị trí nhất định bên trong sợi AND khác để nhân lên, và rồi lại tách ra.

Hiện nay hoàn toàn có thể nhận biết chính xác những đoạn AND đặc hiệu qua chẩn đoán các bệnh đặc biệt. Đối với các bệnh khi các gel chưa được xác định thì việc chuẩn đoán kém chính xác.

Một bộ dò tìm đơn giản chỉ là một khúc ADN hoặc ARN có thể tìm khúc bổ sung với nó bằng cách lai (hybridization). Có thể phát hiện sự bắt cặp này bằng nhiều cách, nhưng phổ biến nhất là sử dụng phương pháp tự chụp phóng xạ với bộ dò tìm có 32p (hình 1.1)

Việc lai bộ dò tìm AND với đoạn AND tách rời gọi là Southern được mô tả trên hình 1.1. Các đoạn ADN hình thành sau khi ADN bị endonucleaza restrictaza cắt sẽ được tách rời ra bằng phương pháp điện di trên gel agaroza. Khoảng cách di chuyển phụ thuộc vào kích thước đoạn. Càng nhỏ càng chạy nhanh. Sau khi đã tách rời, người ra dùng kiềm để làm biến tính các đoạn đó và chuyển chúng lên màng nyclon. Tấm màng này được ủ với dung dịch có chất dò tìm phóng xa, nó chỉ lai với các đoạn AND nào chứa thứ tự bổ sung.

Việc xác định thứ tự ARN (ví dụ mARN) cũng có thể theo trình tự bằng cách điện di ARN trên gel, chuyển lên màng nylon và cho lai với AND probe đặc hiệu.

Phương pháp này gọi là Northern Blotting.

Hình 1.1. Lai bộ dò tìm với đoạn AND, tách ra bằng điện di và chuyển sang tấm nylon (Southern blotting)

1.2. CẤU TRÚC CỦA MÁY ĐIỆN DI

Máy điện di gồm 3 bộ phận cơ bản: khay vận hành (hình 1.2), nắp có điện thế cao và buồng giảm xốc.

Khay vận hành bao gồm khuôn đúc gel. Khay di động trong suốt và bọt đêm bằng caosu.

Hình 1.2. Khay vận hành

Chuẩn bị khuôn gel như sau: lót miếng bọt đệm vào đáy khay di động và sau đó ấn mạnh miếng đệm vào cạnh khay (ép cho đáy khay di động lọt hoàn toàn vào khay khuôn trước khi hàn kín vào miếng bọt

Trên nắp có đầu ra của mã màu, được nối với nguồn điện qua điện cực trên đế máy (hình 1.3). Buống giảm sốc có ống nối điện cực, bục di chuyển và lỗ nạp etylen glycol/ nước với tỷ lệ 50/50 (hình 1.4)

Hình 1.3. Nắp có điện thế cao

Hình 1.4. Buồng giảm xốc

1.3. CẤU TRÚC VẬN HÀNH

1.3.1. ChuẨN bị dung dịch

Chuẩn bị 250 ml dung dịch đệm. Hai dung dịch đệm được sử dụng phổ biến cho điện di AND được chuẩn bị theo công thức pha chế dưới đây.

Mẫu đệm thử

Dung dịch mẫu

(5X; 25% ficoll 400; 25% phenol bromua xanh; 10 ml)

Nước đã được khử ion hóa: 7.0ml

Ficoll 400: 2.5mg

Phenol bromua xanh (F 691.9): 25.0 mg

Nước đã được khử ion hóa: 10.0 ml

Chú ý 1: Sucrora và glyxerol có thể sử dụng để thay thế cho ficoll 400.

Chú ý 2: Xylen cyanol (0.25%) mà di chuyển chậm hơn phenol bromua xanh, thì có thể tăng thêm một lượng nếu mong muốn, sự cô cạn dung dịch agarora được xác định khi thêm vào có liên quan đến polynucleotit.

Thể tích bể

Bảng 1.1. Những loại lược

Chuẩn bị khoảng 7ml dung dịch agaroza ứng với mỗi mililit chiều dày gel (vd: 1 get 3mm cần 0.3x7x10=21 ml)

Hòa tan agaroza trong dung dịch đệm, điều chỉnh nhiệt độ hỗn hợp. Cho phép làm mát dung dịch đến 50oC trước khi rót vào khuôn.

Để quan sát sự phân ly trong hiện tượng điện chuyển thương thêm 0.5mg/ml etydi bromua vào dung dịch gel.

1.3.2. Đúc gel

Thiết bị đặt khay di động: Một tay giữ chặt khuôn đúc, tay kia đặt đầu khay di động áp vào miệng bọt đệm và sau đó hạ thấp rồi đặt lên đoạn cuối của khuôn đúc. Đặt đầu còn lại của khay áp sát vào miệng bọt đệm.

Chuẩn bị lược: Lắp hai rãnh trong lược vào giữa những đầu ốc và mặt sau lược. Siết chặt ốc. Đặt lược vào mép khuôn và chỉnh phần cuối của lược để cách khay di động khoảng 1mm. Siết chặt ốc để giữ chắc lược.

Di chuyển lược: Đặt khuôn lắp ráp lên mặt phẳng nằm ngang. Đặt ống nivo lên khay di động, nó như thiết bị kiểm tra xem khuôn có đúng vị trí nằm ngang không.

Hình 1.5. Mặt sau lược, lắp trên vành của khuôn đúc, vị trí lược tron gel. Hai ốc hiệu lược chỉnh.

Để tạo hai rãnh, đặt lược thứ hai vào giữa gel

Đổ dung dịch agaroza được làm lạnh đến 50oC vào khuôn đúc. Định hướng lược để các bề mặt lược gần miếng đệm bọt nhất và đặt nó lên cạnh khay. Lược luôn luôn ở vào vị trí thẳng đứng để tránh sự vặn vẹo hình dạng. Để chạy lượng mẫu gấp 2 lần, đặt lược thứ hai vào chính giữa khay. Cho phép thời gian tối thiểu để gel đặc lại là 30 phút.

Khi gel đã kết lại, lần lượt tháo lược cẩn thận. Nhấc một phần và nghiêng nhẹ một đầu của lược, sau đó rút từ từ ra khỏi gel (kéo thẳng lược, tạo ra một khoảng không để có thể nhấc gel ra khỏi khay)

Tháo khay di động và gel bằng cách nắm lấy tau cầm của khay, ấn đầu áp vào miếng bọt đệm. Khi khay

đã đã sạch đêm thì nhấc ra. Chuyển khay và gel tới chỗ mát.

1.3.3. Vận hành điện di

1. Làm lạnh nền trước khi tiến hành. Đặc biệt khi dùng điện áp cao hơn hoặc sự phân ly quy định là trên 30 phút.

Chú ý: Để tiến hành phân ly, hoặc là thêm 0.5 mg/ml etydi bromua vào dung dịch đêm hoặc thêm 50mg/ml etydi bromua vào bộ đệm mẫu. Để quan sát, hay cắt điện, tháo phần nắp và giữ đền cực tím gần gel.

Thêm từ từ etydi bromua vào dung dịch đệm hay đệm mẫu. Phát hiện bằng phương pháp này không nhạy bằng cách nhuộm màu và nhìn qua thiết bị soi.

2. Đổ dung dịch vào các khoang sao cho đến khi đệm cao hơn gel khoảng 1mm (khoảng 220ml)

3. Nạp mẫu. Thêm mãu vào 5X bộ đệm tải mẫu và trộn (1/5 thể tích là đệm nạp vào). Sử dụng micropipette để nạp mẫu, chú ý tránh đâm thủng hoặc tạo nên nhiều bong bóng.

4. Đặt nắp để catot (-, dây đen) ở đoạn cuối gần mẫu nhất, (Mẫu axit nucleic di chuyển về phía anot, +, dây đỏ). Nối các dây màu (đỏ với đỏ, đen với đen) tới các nguồn điện, như là R=ESP 2A200. Đặt mức điện áp và thiết bị bấm giờ (nếu có sẵn) theo mức độ phân ly.

Nhanh, điện áp cao

Những ứng dung nào đó, như là kiểm tra các mẫu, có thể thực hiện nhanh dưới điều kiện điện áp cao. Làm lạnh (-20oC) và giới hạn thời gian vận hành 5 ph út hoặc ít hơn ở điện áp 500V.

Chậm hơn, điện áp cao hơn

Một gradient điện áp 12V/cm (150V) trong 30 ÷ 40 phút ( sử dụng dung dịch đệm 1% gel agaroza vaì 0,5 X TBE) cắt Hind III cuả lamda ADN thành các đoạn0,1 ÷ 23 kb. Hoặc dùng dung dịch như vật, mãu này có thể chạy ở 24 V/cm (300V) thì có thể phân cắt trong 20 ÷ 30 phuït. Làm lạnh thiết bị trước khi tiến hành.

Chú ý:

Nếu khổng đổ thêm màu vào chất lỏng làm nguội thì đặt trên nền tối để quan sát dễ dàng hơn.

Đặt thiết bị còn nóng lên nền được làm lạnh cso thể ảnh hượng đến nhiệt độ xung quanh. Nếu sự quá nhiệt không được kiểm soát, gel sẽ tan hoặc thiết bị sẽ cong.

Etydi bromua là chất ăn da mạnh, nên cần mang bao tay

Đeo kính chắn tia UV và bảo vệ da khi sử dụng đèn UV

Tính gradient điện áp, chia điện áp đặt vào cho khoảng cách giữa các cực 12.7 cm.

Bảng 1.2. Điện áp đặt vào và thời gian đề nghị

Ghi chú: (1) để thời gian chạy ít hơn hoặc bằng 20 phút, sử dụng 0,5X TBE và làm lạnh nền đến −200C trước khi sử dụng.

Sau khi phân ly

1-Ngắt điện, tháo dây dẫn, tháo nắp.

2-Nếu không thêm etydi bromua vào gel hoặc mẫu trước khi chạy, nhuộm gel trong dung dịch 0.5 : 1g/ml etydi bromua trong nước hoặc đêm.

3-Làm sạch thiết bị

Vận hành

Các loại gel agaroza được chuẩn bị lần đầu trong khuôn đúc gel. Những mẫu được nạp vào trong các bể chứa và được phân ly. Thuốc nhuộm huỳnh quang có thể được thêm vào chất đệm điện di hoặc gel hoặc cả hai để tìm ra dấu hiệu của quá trình phân ly. Sau khi điện di, gel có thể cho màu, ghi lại màu, thấm màu thêm hoặc sấy tự động.

Đổ đầy lỗ với chất tải lạnh. Dù không làm lạnh đi nữa thì điều quan trọng là phải đổ đầy lỗ với dung dịch làm lạnh đặc trưng trước khi sử dụng vì dung dịch cung cấp nguồn nhiệt cần thiết.

Chuẩn bị 600ml với 50/50 2H2(OH)2/H2O

Để giúp xem các bể chứa được rõ ràng hơn trong khi nạp mẫu, thêm 1 hoặc 2 giọt thuốc nhuộm hòa tan hoặc màu thực phẩm vào dung dịch làm lạnh.

Tìm ra hai lỗ hỏng nạp nước ở phần trên của lỗ. Đổ đầy lõ hỏng đến mức có thể như chất làm lạnh bằng ống phun hoặc máy bơm với 50ml

Bấm nút caosu màu nâu vào mỗi lỗ.

Sắp xếp dung dịch đã chuẩn bị trong thùng đá hoặc bên trong máy lạnh hoặc tủ lạnh để không dưới 20oC trong khoảng 1 giờ trước khi sử dụng (hóa chất được dự trong phòng hay tủ lạnh)

Chú ý:

Không đổ đầy lỗ với chất chống đông thương mại, dung môi hữu cơ hoặc nước cất.

Không cần thiết thay thế chất làm lạnh

1.3.4 Tính kết quả

Hiện tượng điện di chất gel có thể sử dụng những mảnh nhỏ AND khoảng 0.1kb hay nhỏ hơn loại el polyacrylamit thường sử dụng những mảnh nhỏ hơn 1kb.

Tính điện di của AND. Nồng độ agaroza qui định cho quá trình phân ly thành những mảnh vỡ với những kích thước khác nhau được cho trong bảng 1.3

Bảng 1.3. Nồng độ để điện di của các mảnh vỡ AND đối với các loại chất khác

Những nhân tố ảnh hưởng đến kết quả quá trình phân ly bao gồm: chất đệm, điện áp đặt vào, nhiệt độ, cấu tạo và sự có mặt của etydi bromua, các agaroza đặc biệt có sẵn.

Tiêu chuẩn chung cho đoạn Hind III phage λ. Loại cho 8 mảnh vỡ sắp xếp trong khoảng từ 0.1 đến 23 kb cho mỗi cặp 2 sợi.

Để phân giải tốt, di chuyển trên đoạn 10 cm mất 45 phút 1% gel agaroza trong gel 0,5 X TBE ở điện áp 150V.

Tính điện di của ARN

ARN có thể phân chia dựa theo kích thước cơ bản. Để tránh tác động đến thời kỳ chuyển hóa cấu trúc ARN được biến tính trước hay suốt thời gian điện di

VD: ARN đã biến tính trước với glyoxal và glyoxal sunfoxit có thể gel agaroza độc lập, hay ARN có thể Gel agaroza độc lập, hay ARN có thể bị cắt phân đoạn. Gel agaroza chứa hydroxyt thủy ngân II metyl hay focmaldehyt.

1.3.3.Sự phát hiện AND

AND có thể được phát hiện nhờ sự phát huỳnh quang của liên kết etydi bromua (C2H10BrN3) hay nhờ phương pháp chụp ảnh bằng tia X của đồng vị phóng xa AND. Etydi bromua (0,5 µg/ml) có thể được thêm vào dung dịch đệm di chuyển, để quan sát sư biến động của mẫu, vì sự phát huỳnh quang của thuốc nhuộm dưới tác dụng của tia cực tím sẽ được biểu hiện ở dạng dải (để xác định được sự biến đổi đó, tắt nguồn cung cấp năng lượng và chuyển đổi thành phần agaroza cũ ra nắp thiết bị định tia cực tím gần khay vẫn hành. Đặt nắp lại và bật đền để bắt lại sự điện di. Ngoài ra, sau khi điện di, gel biến màu trong dung dịch hòa tan (edydi bromua 10,5 µg/ml H2O) khoảng từ 10 đến 60 phút rồi quan sát và chụp ảnh mẫu bằng phương pháp chiếu tia cực tím.

Để chụp ảnh gel, dùng phương pháp chiếu tia cực tím trên bề mặt tại mỗi vị trí ở đĩa vận hành hoặc di chuyển nhẹ bản gel trên bề mặt sẽ quan sát được tối đa (đĩa vận hành có 95% ánh sang trắng với bước sóng 254mm và 40% ánh sáng trắng với bước sóng 254mm). Quan sát mẫu bằng tia cực tím ở bước sóng 366mm hoặc làm giảm cường độ tia cực tím xuống 302mm để giảm sự phát huỳnh quang của etydi bromua không liên kết, gel có thể bị mất màu bởi sự hút ẩm của nó trong 5 phút với MgCl2 0.01M hoặc trong 1 giờ với MgSO4 0.001M. Sự mất màu đã tạo nên điều kiện dễ dàng để phát hiện hàm lượng AND nhỏ.

1.3.6. Những chú ý cần thiết

Nắp an toàn phải được lắp trước khi nối nguồn điện với nguồn cung cấp năng lượng.

Tất cả các công tắc điện và ngắt nguồn cung cấp điện trước khi tháo lắp an toàn.

Trước khi sử dụng lần đầu, làm đầy lỗ với 1 lượng 600ml 50/50 etylen glycol/ nước để ngăn chặn sự tổn thất không thể hồi phục cho thiết bị. Lỗ chứa lượng trên có thể đổ đầy ngay cả khi không cần làm lạnh theo yêu cầu.

Không sử dụng nước cất, chất chống đông thương mại hoặc bất kỳ dung môi hữu cơ nào để đổ vào lỗ đó. Nước được lấy ra khi đóng băng. Nếu không nó bị hút vào bên trong dung dịch và phá vỡ liên kết. Dung môi hữu cơ sẽ gây ra sự tổn thất hóa chất không thể hồi phục cho thiết bị.

Không làm lạnh lượng dung dịch cho vào lỗ dưới −200C (−40F). Có thể làm lạnh lượng dung dịch đó trong thùng đá, máy làm lạnh hoặc trong tủ lạnh.

Không điều chỉnh nhiệt độ dung dịch đệm hoặc gel trên 50oC. Ngăn chặn sự đun nóng quá nhiệt bằng cách làm lạnh lượng dung dịch đó trước khi sử dụng. Để ngăn chặn sự đun nóng quá nhiệt trong quá trình kéo dài chạy điện áp cao, thay thế lượng dung dịch thứ nhất bằng lương dung dịch thứ 2 đã được làm lạnh. Sự đun nóng quá nhiệt sẽ gây ra sự tổn thất không thể hồi phục cho thiết bị

Làm sạch

Sau mỗi lần sử dụng, làm sạch thiết bị bằng chất tẩy nhẹ và nước, súc cẩn thận vưới nước cất và làm khô bằng không khí. Không được đặt thiết bị vào dung dịch hoặc khí thơm hoặc các hydrocacbon halogen hóa, xeton, este , alcol *trên 30% Hoặc axit đặc trên 25%

Để tránh làm bẩn DNaza và ARNza, ngâm các khoang chứa đệm hoặc khuôn đúc khoảng 10 phút trong dung dich h2o2 3% sau đó súc cẩn thận với DEPC được xử lý rồi cho vào nồi hấp (dùng nước đã được ion hóa để hấp)

1.3.7.Điều chỉnh thiết bị điện di

Bể chắn mẫu. Để cho gel đặc lại tối thiểu là 30 phút và giữ ở nhiệt độ phòng trước khi tháo lược

Khi tháo lược giữ ở cạnh ngắn và nâng nhẹ để tránh gẫy gel

Giữ để không hỏng bể chứa, dung pipet để lấy mẫu, cố gắng cho vào giữa bể bơi và không làm thủng đáy bể

Mẫu thử không chạy dọc theo cột

Nếu chảy thành sợi trên khay bị hỏng thì phải thay thế

Giảm điện áp

Chọn chất đêm với nồng độ và hàm lượng dung dịch đêm thích hợp ( lượng dung dịch đệm TBE chứa nhiều hơn loại TAE)

Nếu chất đệm bị tháo ra hết thì ngưng hoạt động, tháo nắp , dùng ống hút lấy chất đệm từ lỗ khác cho vào bên trong lỗ đối diện đến khi đầy chất đệm

Nếu chất gel không đồng nhất, đặt khuôn đúc nằm ngang trước khi đổ dồn gel ( để làm hòa lẫn vào nhau)

Cặp khuôn đúc

Lược phải đặt thẳng đứng để tránh làm biến dạng bể chứa,